实验室安全与仪器操作规范 专业：

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　　 （注意：实验全程要求穿白大衣、戴手套、口罩） 一、玻璃器皿的清洗及使用

　　（一）洗涤仪器的一般步骤 1.水刷洗：

　　准备一些用于洗涤各种形状仪器的毛刷，如试管刷、烧杯刷、瓶刷等。首先用毛刷蘸水刷洗仪器，用水冲去可溶性物质及刷去表面粘附的灰尘。

　　2.合成洗涤剂水刷洗：

　　市售的餐具洗涤灵是以非离子表面活性剂为主要成分的中性洗液，可配成 1%-2%的水溶液，也可用 5%的洗衣粉水溶液刷洗仪器，温热的洗涤液去油能力更强，必要时可短时间浸泡。去污粉因含细砂等固体摩擦物，有损玻璃，一般不要使用。将滴管、吸量管、小试管等仪器浸于温热的洗衣粉水溶液中，再超声波清洗机液槽中超洗数分钟，洗涤效果极佳。洗净的仪器倒置时，水流出后器壁应不挂水珠。至此再用少量纯水刷洗仪器三次，洗去自来水带来的杂质，即可使用。

　　 作业：你清洗了哪些玻璃器皿？ 注意到了哪些问题 ？ 二、溶液的配制 （一）器材与试剂准备：电子天平，蒸馏水，100ml 量筒，1000ml 量筒，1000ml容量瓶，15ml 管，EP 管，标签纸，磁力搅拌器，搅拌子 1) 10%过硫酸铵（AP） 溶解后 EP 管分装于 4℃保存约 1 周。

　　2）PBS 缓冲液 称取下列药品，用称量纸转移至 1000ml 烧杯中， NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na 2 HPO 4 1.42g KH 2 PO 4 0.27 g 用量筒量取 900ml 的去离子水，在磁力搅拌器上，将药品溶解； 以 HCl 调整pH 至 7.2 后，用 1000ml 容量瓶定容； 然后分装到蓝盖瓶中，高压灭菌后于 4℃保存。

　　过硫酸铵 0.1g 超纯水 1.0ml

　　3）SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液 称取下列药品，用称量纸转移至 1000ml 烧杯中； Glycine（MW75.07） 18.77g Tris（MW121.14） 3.03g SDS 1g 在磁力搅拌器上溶解，用容量瓶定容，室温保存。此溶液回收使用 2~3 次。

　　4）蛋白质转膜缓冲液 称取下列药品，用称量纸转移至 1000ml 烧杯中； Tris base 5.8g Glycine 2.9g SDS 0.37g Methanol（甲醇） 200ml 用 700ml 蒸馏水于磁力搅拌器上溶解，用量筒定容至 800ml，4°保存，使用前以 200ml 甲醇定容至 1000ml。

　　（二）仪器的操作与注意事项 1 1 ）电子天平：

　　 1、调整电子天平水平脚，使水平泡中的气泡处于正中位置。注：电子天平每移动一次位置都需重新调整水泡。

　　2、电子天平接通电源，显示器即显示“OFF”。

　　3、按“ON/OFF”键，电子天平显示所有的符号和标点随后进入自检，通过后显示“0.0000g”即自检通过，进入称量工作状态。

　　简单称重：在万分之一电子天平显示“0.0000g”时，将称重样品放于秤盘上，同时关上玻璃移门，等待电子天平稳定后显示单位“g”，读取称重结果。

　　去皮：在电子天平空盘时显示“0.0000g”，将空容器放在电子天平秤盘上，随后显示容器重量值，按“去皮”键，即显示“0.0000g”。给容器加上称重样品，显示净重量值即为样重值。按“去皮”键后显示“0.0000g”，然后移去称重样品及容器，电子天平显示负的累加值。

　　注意事项：

　　1、在开关门，放取称量物时，动作必须轻缓，切不可用力过猛或过快，以免造成天平损坏。

　　 2、对于过热或过冷的称量物，应使其回到室温后方可称量。

　　 3、称量物的总质量不能超过天平的称量范围。在固定质量称量时要特别注意。

　　4、所有称量物都必须置于一定的洁净干燥容器（如烧杯、表面皿、称量瓶等）中进行称量，以免沾染腐蚀天平。

　　5、为避免手上的油脂汗液污染，不能用手直接拿取容器。称取易挥发或易与空气作用的物质时，必须使用称量瓶以确保在称量的过程中物质质量不发生变化。

　　 2 2 ）量筒：

　　1、会选。任何一只量筒都有一定的测量范围，即量程，要能根据被测量的量选择量程合适的量筒。

　　 2、会放。使用量筒测量时，量筒要平稳地放置于水平桌面上。

　　 3、会看。读取量筒的数据时，若液面是凹形面，视线应以凹形底部为准；若液面是凸形面，视线应以凸形顶部为准。

　　 4、会读。要会根据量筒刻度的分度值读出准确值，同时要读出分度值的下一位，即估计值。

　　 5、会用。量取指定体积的液体时，应先倒入接近所需体积的液体，然后改用胶头滴管滴加。

　　 6、量筒的使用注意事项：不能用量筒配制溶液或进行化学反应。不能加热，也不能盛装热溶液，以免炸裂。量筒上一般标有 20℃字样，这就要求所量液体的温度应控制在 20℃左右，若相差太多， 一是量取的体积有误，二是容易损坏量筒。读数时，视线应与液体凹液面的最低点（或者凸面的最高点）水平相切，若仰视，造成读数偏小，所量液体体积偏大，俯视反之。

　　 3 3 ）H PH 计：

　　1.准备：PH 电极使用前用纯水冲洗，用纸吸干水分，电极连仪表上，接通电源短按(退出)开机，长按 3 秒（退出）关机。

　　2.终点：长按 3 秒（读数/确认）切换手动或自动终点，手动终点时人工判断读数稳定后，需要按下（读数/确认）确认到达终点并锁定读数。

　　3.校准：电极放入任意一 PH 缓冲液中，按（校准）到达终点后，完成一点校准：电极放入第二 PH 缓冲液中，按（校准）到达终点后，完成两点校准：电极放入第三 PH 缓冲液中，按（校准）到达终点后，完成三点校准：

　　4.测量：电极放在样品中，按（读数/确认）到达终点后，即可读取测量值，测量前电极需校准且状态良好，按(设置)切换 PH 或 MV 测量。

　　5.存储回显：测量到达终点后，按（存储回显）存储当前读数，长按（存储回显）回显存储数据，按（退出）退出，长按（校准）回显最后一次校准的零电

　　位和斜率。

　　 作业：你配置的是什么溶液？配置过程中注意到了哪些问题？为什么？ 三、小鼠的处死与组织分离 （一）仪器器材与试剂：剪刀、镊子、冰盒，EP 管，两面板，记号笔，酒精棉球，小鼠，鼠笼，废液缸 （二）操作步骤：提前标记好 EP 管备用。佩戴乳胶手套，通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。正确并准确的抓取小鼠后，断椎处死。把小鼠用图钉（或大头针）固定在泡沫板上，用酒精喷洒小鼠体表进行灭菌，用镊子轻轻夹起小鼠腹腔皮肤，剪开腹膜，暴露腹腔。分离肝脏，分装于 EP 管，放于冰上。

　　（三）注意事项：

　　1．动物抓取：如何避免被动物抓/咬伤：抓取老鼠时，将老鼠拎起放下后，在老鼠身体向前挣扎，不弓背不回头下抓取，抓取过程尽量快、准、狠，以免抓取时间过程过长，小鼠被激惹，易被抓/咬伤。

　　2．分离组织：注意保持组织的新鲜和干净，若沾染了毛发，可用无菌 PBS清洗。

　　 Western blot 流程图

　　 四、组织蛋白质提取与定量 （一）仪器器材与试剂：低温高速离心机、移液器、枪头，玻璃匀浆器，废液缸 （二）操作步骤 组织蛋白的提取：

　　1. 匀浆器和 EP 管放于冰上预冷。

　　2. 取50-100mg 组织在冰上剪成碎片，用预冷的PBS 洗涤2 次，离心弃去PBS。

　　3. 对于肝组织可每 50-100mg 加入 0.5-1ml 预冷的蛋白裂解液匀浆，注意尽量保持低温，快速匀浆。（玻璃匀浆器：小心易碎，取用时应轻拿轻放。玻璃匀浆器两个部分都有数字编号，要两部分都对上才能匹配使用。否则会因不匹配导致玻璃仪器破碎） 4. 13000rpm 离心，4℃，20min。取上清转移至另一 EP 管中，弃沉淀。

　　5. 13000rpm 离心，4℃，15min。转移上清至另一 EP 管保存。

　　 低温高速离心机的使用及其注意事项：

　　1.插上电源，打开离心机开关；使离心机预冷 20min 左右； 2.使用 time（时间）键设定离心时间，旋转 speed(速度)键设定转速或相对离心力； 3. 打开预冷好的离心机，旋开离心机转子盖，将装有样品的离心管先在天平上平衡，然后擦干离心管外壁放入离心机中，盖上离心机的转子盖以及离心机盖，按 start/stop 键启动离心；

　　4．.离心停止后，取走离心样品； 5 离心机盖敞开，关闭离心机电源，待离心机内壁冰融化后用软毛巾擦去离心机内的水分和转头； 6. 盖上离心机转子盖，合上离心机盖，按离心机开关键关闭离心机，拔下插头； 7.每次预冷前或操作完毕后，应作好离心机使用情况的详细记录。

　　 注意事项 1. 正确使用工具准确安装所需规格的转头；检查转头安装是否牢固；机腔有无异物掉入；且机盖上不得放置任何东西。

　　 2. 离心管外壁须擦干，与样品一起以托盘天平平衡 (若用管套，也需平衡)，然后成偶数、对称放入转头中。

　　 3. 必要时预冷转子，需要关闭机盖，建议将转头和转头盖拧紧一起预冷；离心机在运转时，不得移动离心机。

　　 4. 转速设定不得超过最高转速，以确保安全运转；开机运转前请务必旋紧转子盖(转头与盖之间应无缝隙)，以免高速旋转时飞出造成事故。

　　 5. 不要使用劣质、老化、损坏的离心管；若运行时有离心管破裂或样品放置不平衡，会引起较大振动，应立即停机处理。

　　 6. 离心机完全停止转动后方可打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁冷凝水；擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。

　　 7. 每次离心完成后，尽量要将转子取出后倒置放在实验台上；长时间放在转轴上，可能导致转子锈死取不出；转头的维护和存放要注意保护底部的计数环。

　　 8. 每次停机后再开机的时间间隔不得少于 5 分钟，以免压缩机堵转而损坏；离心机一次运行时间最好不要超过 60 分钟。

　　 9. 在离心过程中，操作人员不得离开离心机室；发生异常情况不能关电源 POWER，而要按 STOP。

　　 10. 离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。

　　 11．每次预冷前或操作完毕后，应作好离心机使用情况的详细记录。

　　 移液枪的使用及其注意事项：

　　1 调节量程 在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调法， 逆时针旋转旋钮即可，但如果要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转

　　刻度旋钮至超过量程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高 精确度。在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置 而损坏了移液枪。

　　2 装配枪头(吸液嘴) 在将枪头套上移液枪时，正确的方法是将移液枪垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。枪头卡紧的标志是略为超过 O 型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈。

　　 3 移液的方法 移液之前，要保证移液枪、枪头和液体处于相同温度。吸取液体时，移液枪保持竖直状态，将枪头插入液面下 2-3 毫米。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴(尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时)。这时可以采取两种移液方法。

　　一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。

　　二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点排出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点(千万别再往下按)，取下有残留液体的枪头，弃之。

　　4 移液枪的正确放置 使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。当移液枪枪头里有液体时，切勿将移液枪水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。

　　 五、A BCA 试剂盒测定蛋白浓度 （一） 产品编号 产品名称 包装 P0009-1 BCA 试剂 A 500ml/瓶，共 2 瓶 P0009-2 BCA 试剂 B 30ml P0009-3 蛋白标准(BSA) 30mg/管，共 2 管 P0009-4 蛋白标准配制液 5ml 保存条件：室温保存。蛋白标准配制成溶液后-20℃冻存。

　　 注意事项：

　　需酶标仪一台，测定波长为 562nm 最佳。需 96 孔板。

　　使用说明：

　　1. 取 1.2ml 蛋白标准配制液，加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成 25mg/ml 的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

　　 2. 取适量 25mg/ml 蛋白标准，稀释至终浓度为 0.5mg/ml。例如取 20ul 25mg/ml蛋白标准，加入 980ul 稀释液即可配制成 0.5mg/ml 蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl或 PBS 稀释标准品。稀释后的 0.5mg/ml 蛋白标准也可以-20℃长期保存。

　　 3. 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B(50:1)配制 BCA工作液，充分混匀。例如 5ml BCA 试剂 A 加 100ul BCA 试剂 B，混匀，配制成 5.1ml BCA 工作液。

　　BCA 工作液室温 24 小时内稳定。

　　 4. 制作标准曲线：从 1-8 标记 8 个 EP 管。1 号管加 200ul 的 0.5mg/ml 蛋白标准缓冲液，2-7 号管加入 100ul PBS。从 1 号管取 100ul 溶液，加入到 2 号管，充分混匀；再从 2 号管取 100ul 溶液，加入到 3 号管，充分混匀，依次这样下去，直到 7 号管。8 号管作为空白对照，加 100ul PBS。上样：1-8 号管分别取 20ul到 96 孔板上对应的孔中，每孔做两个平行。

　　 5.加 5ul 样品和 95ulPBS 充分混匀，分别取 20ul 到 96 孔板上，每孔做两个平行。

　　 6. 各孔加入 200ul BCA 工作液，37℃放置 30 分钟。

　　注: 也可以室温放置 2 小时，或 60℃放置 30 分钟。BCA 法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。

　　 7. 测定 A562，540-595nm 之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

　　 测浓度所需仪器：原子吸收室 Gene Synergy Ⅱ多功能酶标仪 仪器操作步骤：

　　接通电源，先开仪器，待仪器自检结束后，打开电脑，点击桌面上 Gene5 1.07 软件，进行设置检测所需参数。

　　protocol→procedure→read→wavelengths 里 562nm→full plate 选目的孔 plate layout→type 设置 sample 孔，保存 protocol，命名。

　　于 experiment 里调取 protocol 后进行读板，Excel 输出数据进行分析。

　　绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。

　　（二）注意事项 1．常见问题：

　　 1.1 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化。

　　 可能的原因是样品中含有严重干扰 BCA 法测定蛋白浓度的物质。

　　 1.2 是否每次测定时都需要做标准曲线？ 建议每次测定时都做标准曲线。因为 BCA 法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。

　　2．取上清时，宁少勿多。勿取到下层。

　　3．测浓度时，加样要小心，保证平行的一致性，得出的标准曲线才比较可靠。4. 尽量保证样品浓度在标准曲线范围内。如果样品浓度不在标准曲线范围内，采用浓缩或稀释的方式（如果是稀释,需要用原有体系的溶剂）,使之在落在线性范围之内。

　　4.玻璃匀浆器：小心易碎，取用时应轻拿轻放。玻璃匀浆器两个部分都有编号，要两部分都对上才能匹配使用。否则会因不匹配导致玻璃仪器破碎。

　　 作业：你在提取组织和破碎组织中遇到了什么问题？如何解决的？ 六、 SDS- -E PAGE 准备

　　（一）仪器器材与试剂：离心机、移液器、废液缸 Tris-HCl PH6.8，30%丙烯酰胺，10％过硫酸胺，TEMED，10%SDS，Tris-HCl PH8.8 （二）操作步骤 1.SDS 聚丙烯酰胺凝胶配制 A：做胶前的准备 1)检查是否有足够的、干净的 spacer，comb 和架子。本次实验使用 1.0mm的 spacer，comb。

　　2)检查是否有新鲜的、足量 10%APS，没有立刻重配。

　　3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并查找分离胶各组分的用量。本次实验以 10%胶为例。

　　 B: 制胶，电泳 1)装好架子。将玻璃板和梳子等物品用水洗干净，临用前用乙醇擦拭，挥发至干。（注意没有毛刺，内侧不要用手碰）。检查整个装置不漏（十分重要） 2)配 10ml 分离胶。在胶上面加入一层异丙醇，促进胶更好的凝集。至少 40分钟凝固，倒掉水，用吸水纸吸干。

　　3)配制 3ml 浓缩胶，倒好后插入预先准备好的梳子。

　　 配制 10%的分离胶 10ml，则：

　　 配制 5% 的浓缩胶 3ml SDS-PAGE 分离胶浓度 最佳分离范围 6%胶 50-150kD 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-40kD 蒸馏水 2.7ml 30%丙烯酰胺 3.3ml 10％过硫酸胺 0.1ml TEMED 0.004ml 10%SDS 0.1ml Tris-HCl PH8.8 3.8ml 蒸馏水 2.1ml

　　 （三）注意事项 1. 检查整个装置不漏十分重要，可以架好装置后加水试验。

　　2. 根据情况选择胶的厚度，对应好相应厚度的梳子。

　　3. 。

　　分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。

　　 4. 上样蛋白量不应超过 30ug/mm2 (载荷面积：如果你的胶槽是 5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。

　　5. gel 通常在 0.5-1h 内凝集最好，过快表示 TEMED、APS 用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或失效。

　　 6. 烧杯中剩余的胶溶液不要倒掉，可以观察作为 E PAGE 胶是否凝固的参照。

　　 7. 混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。

　　8. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护。

　　9. 记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己（未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢毒害你的身体） 作业：你制作的 SDS-PAGE 如何？制作过程中有哪些关键问题？ Tris-HCl PH6.8 0.38ml 30%丙烯酰胺 0.5ml 10％过硫酸胺 0.03ml TEMED 0.003ml 10%SDS 0.03ml

　　七、蛋白变性与上样 （一）仪器器材与试剂：移液器、干式恒温器、废液缸、蛋白样品、5×SDS loading buffer （二）操作步骤 1. 计算出蛋白样品的浓度后，通过稀释将蛋白浓度调至基本一致。计算上样量（30ug-100ug）对应的体积，最好不要超过 15ul。

　　2. 蛋白样品和 5×SDS loading buffer 按 4:1 的体积，于干式恒温器上 95℃5min，保存于-20℃。

　　（三）注意事项 干式恒温器应提前打开预热设置为 95℃，5min。

　　 作业：你的蛋白质浓度测定结果如何？你觉得准确吗？为什么？ 八、蛋白质 SDS- -E PAGE 胶电泳 （一）仪器器材与试剂：低温高速离心机、移液器、废液缸，电泳液，电泳槽,marker ,样品蛋白，绿色小板 （二）操作步骤 1)上样，电泳。装好电泳装置，加入电泳液，内部加满，外部加到 2Gels线位置。按预定顺序加样，每样品加 10µl 左右为好（不能超过 30µl），把样品加到样品孔底部（从左至右加 marker 4ul，样品蛋白，根据样品数量，可选择10 孔或 15 孔梳子）上层胶用 60-80V 电压，当样品至分离胶时，用 100-120V 电压。电泳时间在 1.5 小时左右。

　　2)关闭电源，直接倒掉电泳液，从电泳装置上卸下玻璃板，放在手上；大板在下，小板在上，用专用的绿色小板从任何一侧小心的撬开玻璃板，取走短玻板，切除浓缩胶，然后转移分离胶至转移缓冲液浸泡清洗一次，然后放入转移缓冲液等待转移。

　　（三）结果分析 电泳中常出现的一些现象：

　　︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。

　　︵ 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

　　拖尾：样品溶解不好。

　　纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。

　　条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。

　　条带两边扩散：加样量过多。

　　（四）注意事项 1．电泳前，电泳装置也要观察是否渗漏，渗漏对电泳效果也有一定影响。放置胶板时，小板朝内，长版朝外，卡置槽内，两边同时用力，合上架子。

　　2．电泳装置内倒入电泳液至满后，要除去液面上泡沫，保证电泳效果。

　　3．电泳时应常观察电泳情况，注意电压电流，电泳时间过长会导致蛋白弥散等。

　　 九、考马斯亮蓝染色与脱色 （一）仪器器材与试剂：考马斯亮蓝染液，脱色液,蒸馏水,废液缸,微波炉,摇床,塑料盒 （二）操作步骤（谷歌生物·考马斯亮蓝染色方案，具体操作步骤按照说明书进行） 1. 电泳结束后，取出凝胶先放入蒸馏水中洗两遍，再加入适量的考马斯亮蓝染液中，以染液刚好覆盖凝胶为宜。加入微波炉中加热到 70-80℃，期间应避免染液沸腾导致凝胶破碎。

　　2. 随后在染色液较高温度的情况下，在室温摇床上染色 5min 左右，直到能够看到清晰的蛋白条带为止。

　　3. 倒出染液，加入适量的脱色液覆盖凝胶，加入微波炉中加热到 70-80℃，期间应避免染液沸腾。在保持脱色液较高温度的情况下，脱色 20-30min，期间可更换 2-3 次脱色液，直到达到预期的染色结果为止。

　　4. 完成脱色后可将凝胶保存在水中或含有 20%甘油的水里，尽快拍照。

　　（三）注意事项 处理胶的手法应轻柔，避免胶破碎。

　　 作业：展示你的染胶，你对结果满意吗？实验过程是否存在问题？

　　 十、蛋白质转移 （一）仪器器材与试剂：蛋白质转膜缓冲液，NC 膜.滤纸.剪刀,玻棒,转移槽,离心机、移液器、废液缸 （二）操作步骤 1. 电泳结束前 20 分钟左右戴上手套开始准备：使用常规电转液浸泡 NC 膜：将 NC 膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中 10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。

　　2. 取胶：

　　将胶卸下，保留 30-100KD 或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（以防止短路） 3. 转膜：

　　①转一张膜需准备2张滤纸（厚度约2mm）和1张NC膜。将切好的NC膜轻轻放入一盘盛有转膜液水面上，NC膜会借毛细作用之从下往上湿润，然后将之浸没于溶液中，浸泡5min以上，防止膜上留有气泡，影响转膜的效果，最后在盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸。

　　② 将夹子打开白面向上，黑面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以赶走里面的气泡。在垫子上垫1层滤纸，一手用镊子固定滤纸一手用

　　玻棒擀去其中的气泡。

　　③ 先将玻璃板轻轻撬开，除去小玻璃板后，将玻璃平放在一张白纸上，这样marker看的更清楚，便于切胶。将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作)，要注意保护分离胶以免刮破。小心剥下分离胶在转莫液中润洗一下后轻轻放于滤纸上，调整使其与滤纸对齐，再用玻棒擀去气泡。将膜铺于胶上，膜最好比胶大些，以保证把胶全部覆盖(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖另一张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可以将夹子合起。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。(转移液中含甲醇，操作时要戴手套口罩，实验室保持空气流通。) ④ 将夹子放入转移槽中，（注意黑面对黑面，白面对红面）加入转膜液直至没过夹子中的膜即可。电转移时会产热，可将转移槽放入装有碎冰的泡沫盒中进行，60V转膜1.5hrs。

　　（三）注意事项: 1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。

　　2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。

　　3）因为膜的疏水性，膜必须首先在转膜液中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润。

　　4）转移时间一般为 1.5 小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。

　　 作业：你的转膜过程是否存在问题？如果有问题，你采取了什么补救措施？ 十一、丽春红染色（ 30min ） （一）仪器器材与试剂：丽春红工作液，蒸馏水、玻璃皿、（废液缸） （二）操作步骤 1. 将PVDF膜，硝酸纤维素（NC）膜或醋酸纤维膜浸没在丽春红工作液中，染色半分钟或更长时间。

　　2. 将染色后的膜于蒸馏水中漂洗数秒，直至出现清晰的蛋白条带并及时拍照。

　　3. 用蒸馏水、PBS或其他适当溶液漂洗2-3次，每次3-5min，去除丽春红，进行后续的western实验。

　　 作业：展示染色膜，你对结果满意吗？实验过程是否存在问题？ 十二、 抗原抗体孵育 （一）器材与试剂准备：电子天平，蒸馏水，100ml 量筒，1000ml 量筒，1000ml容量瓶，50ml 管，标签纸，磁力搅拌器，搅拌子,pH 计 1) pH7.51mol/L Tris-HCl Tris(121.14g/mol) 30.29g，用 200ml 蒸馏水溶解后，浓盐酸调 pH 至所需点，最后用蒸馏水定容至 250ml,高温灭菌后室温下保存。

　　 2) 洗膜缓冲液(TBST) 称取下列药品，用称量纸转移至 1000ml 容量瓶中； 1mol/L Tris.HCl（pH7.5） 10ml NaCl 8.8g Tween20 0.471ml 用蒸馏水定容至 1000ml。

　　 3）封闭缓冲液 脱脂奶粉 1g TBST 20ml （二）操作步骤 1.封闭 转移结束后将膜放入封闭缓冲液后放于摇床上室温 1.5 小时。

　　 2.孵育一抗 A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。

　　B. 配好 5%的 Milk(TBST 溶解)，按要求稀释好抗体,一般采用 4℃过夜或者室温

　　下轻摇孵育一小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。

　　 3. 洗涤 置于摇床上用 TBST 洗三次,每次 5min。

　　 4．孵育二抗 一般采用 HRP 标记的二抗，稀释比例为 1:5000。孵育时间为置于摇床上常温 1.5小时. 5. 洗涤 置于摇床上用 TBST 洗三次,每次 5min。

　　 6. 增强化学发光法(ECL) 1. ECL 显色液的配制：将 A 液和 B 液各 500μl 按照 1：1 混匀。

　　2. 显色：将配置好的ECL显色液平铺在膜上，充分接触2min，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，将膜转入暗盒，带入暗室曝光。

　　 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。

　　 全程手套操作，避免手印污染影响结果，同时保护自己（未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但会慢慢毒害你的身体 作业：WB 结果，你对自己的结果满意吗？实验过程是否存在问题？ 鼠尾基因鉴定（ Genotyping ） 一、器材与试剂准备

　　器材：制冰机、离心机、涡旋机、电泳仪、 PCR 扩增仪、干式恒温器、移液枪（2.5μL、10 μL 、200 μL 、1000 μL ）、微波炉、磁力搅拌器、电子天平、冰盒、记号笔、样品板（2 个）、废液缸（两个）、酒精棉、96 孔板、膜、容量瓶（100mL）、EP 管（1.5mL）、PCR 管、剪刀、镊子、枪头（蓝、黄、白）、棉花。

　　试剂：琼脂糖、快速 DNA 提取扩增试剂盒、DEPC 水、三蒸水、marker（东盛）、TAE 缓冲液。

　　 E TAE 配方（ 50 ×） Tris 24.2g NaEDTA.2H 2 O 3.72g 加入 H 2 O 80mL 磁力搅拌器充分搅拌至溶解后加入 5.71mL 的醋酸，充分混匀; 蒸馏水定容至 100Ml. 使用前需稀释为 1 1 ×的: : 稀释举例：需要 200mL: 则 4mL 50×TAE，196mL 去离子水，混匀。

　　 二、组织提取 器材：EP 管（1.5mL）、记号笔、样品板、剪刀、镊子、棉花（止血）、酒精棉、废液缸。

　　取组织之前提前 半小时至一小时 打开制冰机。

　　 将 EP 管编号，放在样品板上。固定小鼠，用酒精棉对小鼠尾巴进行消毒，待酒精挥发干后，剪取一小段到 EP 管中（5mm 左右）。

　　 三、样品处理（根据试剂盒操作说明进行） 试剂和器材：剪刀、快速 DNA 提取扩增试剂盒、EP 管（1.5mL）（编号）、 涡旋机、4℃离心机、干式恒温器、移液枪（200uL、10uL）、冰盒、枪头、冰盒。

　　（1）将鼠尾剪碎。

　　（2）加入 200 µL 1 × Mouse tissue Lysis Buffer ，涡旋混匀 。

　　（3）加入 4 µL Proteinase K，涡旋震荡混匀。

　　 （4）干式恒温器 56℃孵育 30min 。

　　（5） 孵育完成后，将样品置于干式恒温器 95℃或者沸水浴中加热 5 min 灭活Proteinase K。

　　（6）将 EP 管编号（同上面取组织编号一一对应）。

　　（7）将裂解产物涡旋震荡充分混匀后，12000 rpm 离心 5 min，将上清转移至另一个编好号的灭菌 EP 管中，用于 PCR 扩增，保存于- 20℃可存放至少三个月。

　　四、R PCR 扩增：

　　：（在冰盒里操作）

　　器材：96 孔板、剪刀、膜、移液枪（2.5uL、10uL）、白枪头、样品板、TDZ5-WS低速多管架自动平衡离心机（转速 800、转子选为 2）、冰盒、制冰机、PCR 板。

　　2 × PCR Master Mix (Dye Plus)解冻完全后，上下颠倒混匀。于冰水浴中配制如下反应体系：

　　反应体系：

　　组成成份 体积 2 × PCR Master Mix (Dye Plus)* 1 10 µL 正向引物（ 2.5 µM） 3.2 µL 反向引物（ 2.5 µM） 3.2 µL 模板 DNA 1 µL 灭菌水 2.6µL 引物浓度：2.5µM R PCR 反应循环的设置：

　　 *退火温度需要根据引物Tm值进行调整，一般设置成低于引物Tm值1-2℃即可。

　　结果检测：

　　反应结束后取 5 µL 反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

　　* * 扩增产物直接进行琼脂糖电泳检测，无需添加 DNA Loading Buffer 。

　　 五、琼脂糖凝胶电泳 （1）胶板制备 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶模具中，固定，置于水平面。

　　（2）制备琼脂糖凝胶 （ 2% ） ( ( 小胶) )用电子秤称取 0.7g 琼脂糖于 50mL 烧杯中，用移液枪加入 35mL 1×TAE 缓冲液，微波炉(解冻或中火火力)加热煮沸 3 次至琼脂糖全部融化,摇匀,30s 内加入 1.75uL 的 GoLdview，摇匀。

　　( ( 中胶) )用电子秤称取 1.2g 琼脂糖于 200mL 烧杯中，用移液枪加入 60mL 1×TAE 缓冲液，微波炉(解冻或中火火力)加热煮沸 3 次至琼脂糖全部融化,摇匀30s 内加入 3uL 的 GoLdview，摇匀。

　　（3）倒胶 将琼脂糖凝胶液小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。在固定位置插入梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固,约15-30min。

　　（4）点样 胶凝固后，垂直轻拔梳子，从模具中取出制胶槽，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加 1×TAE 电泳缓冲液至没过胶板 1-2mm 为止。marker 和样品的上样量均为为 5uL。用 10 μL 微量移液枪分别将样品加入胶板的样品小槽内。中间为 marker。每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). （5）跑电泳 电泳条件：60V，1.5h。

　　 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1-2cm 处时,停止电泳。

　　（6）结果观察 观察照相:在紫外灯下观察,DNA 存在则显示出绿色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存. 照相所需仪器：凝胶成像室 AlphaImager HP 仪器操作步骤：佩戴手套打开电脑（仅该仪器），点击桌面 Alpha，先于白光（white）下让仪器自动聚焦，调节胶的位置，然后于紫外光下（UV）成像，调节电脑和仪器上的 Filter Wheel Position 于 2，点击 acquire 获取照片。不可直接于紫外光下观察，无白光下的聚焦，紫外光下可能无法观察到结果。

　　六、注意事项 1.制胶前先调节制胶槽子的水平。

　　2.倒胶力度需均匀，一气呵成，胶厚度不宜过薄或过厚。倒好后，观察胶是否符合实验条件。不合适的胶，可回收重新加热再倒胶。

　　3.拔出梳子时小心均匀用不要损坏凝胶槽。

　　4.点样位置：靠近负极一端凝胶凹槽。

　　5.注意移液枪枪头不要损坏凝胶槽。

　　6.点样后在凹槽内移液枪不能倒吸。

　　7.点样后不能再移动电泳槽位置。

　　8.注意电泳电源正负极不要接反。

　　 附表：分离不同大小的 DNA 片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表。

　　凝胶浓度（%） 线性 DNA 分子的有效分离范围（bp） 0.5 1000～30000

　　0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000 七、课堂作业：请张贴您的结果，并指出您的样品。